阐明真核生物中启动DNA复制的关键步骤

生物化学教授BrandtEichman和WalterChazin共同努力，让人们更好地了解DNA复制在真核生物中到底是如何启动的。Eichman、Chazin和他们的同事利用范德比尔特结构生物学中心冷冻电子显微镜设施中最先进的仪器，提供了多功能蛋白质的详细可视化效果，这揭示了DNA复制是如何启动的在人类中。

艾希曼和查津分享了对这项研究的看法，最新发表在《自然结构与分子生物学》杂志上。

您的研究解决什么问题?

我们对人类DNA复制的分子细节感兴趣，这是生命最基本的过程之一;当我们制造新细胞时，它每天都会重复数百万次。新的DNA拷贝由聚合酶合成，聚合酶一次读取一个核苷酸的现有DNA链的序列，并将互补核苷酸添加到新生的DNA链中。

特定的聚合酶执行大部分DNA合成，但如果没有新链的短“引物”片段，它们就无法发挥作用。

这项工作探讨了DNA聚合酶α-primase(polα-primase)的分子机制，该酶负责合成引物。Polα-引物酶是一种必需的酶，因为它是唯一可以通过生成其他聚合酶复制基因组所需的引物来启动DNA合成的聚合酶。

尽管polα-引物酶是第一个被发现的人类聚合酶，但50多年来，它在单链中合成非常特定长度的RNA和DNA的方式仍然不清楚。它如何知道在转入DNA合成之前已经合成了特定数量的RNA核苷酸?它如何在两种模式之间转换?它如何知道在停止之前已经合成了一定数量的DNA核苷酸?

了解polα-primase能够“计算”引物的RNA和DNA片段长度的能力非常重要，因为引物必须保持非常短的长度，因为它们在新DNA链中包含RNA以及由引物合成的DNApolα充满了突变。因此，如果引物成为复制后保留在基因组中的新DNA链的重要组成部分，那么它们将对细胞非常有害。

为了回答这些悬而未决的问题，我们使用冷冻电子显微镜捕获了这种多功能蛋白质在生成引物时各个阶段的快照。我们确定的高分辨率结构阐明了polα-引物酶对RNA和DNA进行计数的机制。它们还为设计新型polα-引物酶功能小分子调节剂提供了一个起点，这将为研究细胞中DNA复制提供新方法。

您的研究方法有何独特之处?

Eichman和Chazin实验室合作多年，致力于了解polα-引物酶的工作原理。我们可视化了与核酸底物结合的polα-引物酶的一些最初结构。引物/模板底物的高度战略性设计使我们的团队能够在引物合成途径上的几个特定点“捕获”酶。重要的是，这项研究是通过使用CSB冷冻电子显微镜设施中最先进的仪器而得以实现的。

你的发现是什么?

我们的数据直接表明，polα-引物酶在整个合成的所有阶段都固定在引物的一端。这一观察结果对于理解最初的RNA引物模板如何从一个亚基中的引物酶活性位点(发生RNA合成的地方)传递到另一个亚基中(发生DNA合成的地方)的DNA聚合酶活性位点至关重要。

持续附着还可以增强polα-引物酶与模板保持结合并调节RNA和DNA组成的能力。重要的是，对结构的详细分析揭示了这种四亚基复合物内的灵活性对于跨两个活性位点合成引物链至关重要。

此外，我们的研究表明，随着更多DNA的合成，模板的polα和引物酶亲和力的减少会促进DNA合成的终止。

您希望研究成果能取得什么成果?

我们希望我们的研究结果能够阐明该领域对复制起始的更全面的理解，并有助于人们日益认识到复杂的分子机械需要灵活性和动态性才能发挥作用。这种复杂的多亚基聚合酶固有的灵活性对于引物合成及其与复制体中存在的多种其他酶动态相互作用的能力至关重要(例如，用于将引物传递给复制聚合酶以进行批量DNA合成)。

我们还希望这项工作能够更好地理解当前的polα-引物酶抑制剂的工作原理，并更广泛地为未来设计小分子调节剂作为研究细胞中DNA复制的工具铺平道路。这种类型的工具化合物还可用于评估靶向在基因组不稳定疾病中起作用的特定复制蛋白的治疗潜力。