对荧光暗态的新见解为改进成像指明了方向

圣犹达儿童研究医院的科学家报告了一种利用单分子荧光共振能量转移(smFRET)来改善分子尺度距离测量的方法。smFRET可以量化称为荧光团的化学物质的激发和发射特性。该研究结果发表在《自然方法》杂志上。

当荧光团中的激发电子松弛时，它会在延迟后发光，导致分子发光(荧光)。然而，荧光团在激发后并不总是会发出荧光。相反，通过与激发电子的“自旋”状态相关的量子力学过程，它们可以进入不发出荧光的长寿命三重态暗态。

这降低了smFRET测量的灵敏度和准确性。通过“自我修复”技术控制暗态的持续时间，圣犹达的科学家现在证明，三重态暗态可以得到极大缓解。

这一进步显著提高了该方法的分辨率，推动了分子成像领域的发展。

smFRET捕捉转瞬即逝的分子瞬间

捕捉蜂鸟翅膀的扇动需要专用相机，其帧速率高，照明条件要好，避免快速运动造成的模糊。与捕捉我们体内生物分子功能的挑战相比，可视化蜂鸟的飞行就显得微不足道了。

生物分子比光的波长还小(约为十亿分之一英寸)，它们的功能与运动有关，每秒会改变位置或形状(构象)数百至数千次。

测量这些短暂的动态对于真正了解分子如何发挥其功能、这些功能在疾病中如何受到干扰以及药物疗法如何改变其活动至关重要。smFRET是一种分子成像技术，是一种直接可视化生物分子如何实时和在单分子尺度上移动的有效方法。

在圣犹达儿童研究医院，结构生物学系和化学生物学与治疗学系的ScottBlanchard博士正在推动smFRET成像领域的发展。Blanchard实验室通过圣犹达儿童研究医院单分子成像中心的努力对于设计和开发能够进行分子级测量的荧光团至关重要。

“最常见和最广泛使用的荧光分子通常无法胜任在分子尺度上量化事件的任务。这促使我们接受合成我们自己的荧光团的挑战，”布兰查德说。“在此过程中，我们意识到荧光的基本光物理需要改变。”

为了进行smFRET实验，研究人员将荧光团放在生物分子的两个点上。当激光照射到第一个荧光团(供体)时，其中的电子获得能量，并被激发。

当电子松弛时，该能量会通过空间转移到第二个荧光团(受体)，但前提是该荧光团靠近供体。通过记录和量化供体和受体荧光团的荧光爆发，可以测量十亿分之一英寸的距离。

每条信息对于理解生物功能和故障都至关重要。然而，正确使用该技术需要仔细掌握荧光的基本特性。

电子自旋翻转锁定在三重态

荧光团发光的规则与电子自旋有关。当激发电子松弛时，它应该回到其原始状态，保持其自旋状态或自旋量子数。然而，这种情况并不总是发生。

高空间分辨率smFRET成像。来源：NatureMethods(2024)。DOI：10.1038/s41592-024-02293-8

《自然方法》研究的通讯作者布兰查德说：“每当电子被激发时，它就有可能会失去对自旋的记忆，并采用反转自旋状态。”

“虽然这个过程相对罕见，大约只有1/100的概率，但如果它确实改变了自旋状态，那么它最终会处于这种寿命长100,000倍的三线态，不会发出荧光。因此，荧光团会变得比原本暗得多。

Blanchard补充道：“荧光领域多年来一直在努力解决这个问题。在FRET的背景下，我们注意到三线态积累会随着照明强度而变化，并且因不同的荧光团而异。”

FRET要求供体和受体荧光团的行为方式相同。但是，由于该技术需要直接激发一个荧光团，而不是另一个荧光团，因此当你打开激光时，供体和受体的三线态会以不同的速率被占据。

“最终，你会经历一个令人晕船的过程，其中供体和受体处于不同的水平，因此它们的性能下降程度也不同，”布兰查德解释道。“实验读数变得各不相同，导致成像数据的质量和可靠性下降。这从根本上限制了smFRET测量的空间和时间分辨率极限。”

因此，荧光团工程研究的一个关键目标是尽可能缩短三线态的寿命。这是“自修复”技术的基本目标。

“为了确保smFRET数据中的距离测量准确，该领域目前依赖于不明确考虑三重态的校准步骤，”共同第一作者、圣犹达结构生物学系博士ZelihaKilic解释道。

“自愈技术使该领域更接近不存在三线态的最佳条件，确保所采用的校准步骤产生更准确的结果，从而进行距离测量。”

自修复荧光团指引方向

被称为三线态猝灭剂的化学物质，如环辛四烯，可以抵消这种现象，但也容易使工作变得混乱。“环辛四烯很油腻，溶解度变化多端且低，而且难以控制，”布兰查德说。

Blanchard团队之前发表的文章报道了直接连接环辛四烯的荧光团的开发。这种方法解决了溶解度问题，并创建了“自修复”荧光团，其中三线态占据率降低了1000倍。

在这项新研究中，研究人员证明，在smFRET实验中使用自修复荧光团作为供体和受体可以提高数据质量和可靠性，并防止随着激光强度的增加而导致成像质量下降。这些改进推动了smFRET的发展，自修复荧光团技术在世界范围内的应用越来越广泛。

“自修复荧光团增强的亮度和光稳定性使得显著提高smFRET成像的时空分辨率成为可能，”共同第一作者、原圣犹达结构生物学系、现比尔拉理工学院的AvikPati博士说道。

“我们现在可以在亚毫秒和生理氧浓度下稳健地量化单个生物分子内的纳米级构象动力学。”

Blanchard相信这些发现将帮助圣犹达研究人员和更广泛的科学界。“推动圣犹达成像创新的前沿是该机构战略计划的一部分，我们相信自修复荧光团将在实现我们的目标中发挥重要作用，”他说。

“此外，许多人可能会受益于这些进步，因为自修复方法已显示出改善大多数荧光应用的潜力。”