研究人员揭示通过工程化关键门控残基增强P450去甲基化酶活性的新机制

木质素降解利用过程中的关键步骤是木质素单体的O-脱甲基化，而O-脱甲基化酶是该过程的重要推动力。目前的O-脱甲基化酶面临底物特异性有限、反应机制不明确、还原酶伴侣缺乏等挑战。因此，通过基因挖掘寻找新型O-脱甲基化酶和通过蛋白质工程改造现有的O-脱甲基化酶具有重要意义。

沼泽红假单胞菌HaA2菌株的细胞色素CYP199A4单加氧酶是少数已知能催化木质素单体衍生物脱甲基化的细胞色素P450酶之一，但其脱甲基活性依赖于烟酰胺辅因子NADH和还原性分子伴侣蛋白的存在。

中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇教授团队通过创新的工程策略，将NADH依赖的CYP199A4改造成可直接利用H2O2的过氧化酶，该技术被称为H2O2。

他们还开发了一个突变CYP199A4过氧化酶库，用于研究21种木质素单体类似物的O-脱甲基化。经过改造的CYP199A4过氧化酶表现出在特定位点催化反应的偏好，转化率令人印象深刻，超过或匹配天然底物4-甲氧基苯甲酸。

研究人员还高分辨率解析了有利突变体的晶体结构。结构分析显示，突变酶的空间位阻减小，疏水残基特异性增强，活性位点内水分子含量增加。

这表明H2O2分子可能更容易进入活性位点，支持特定氨基酸残基调节H2O2参与反应的机制。

此外，研究人员利用经典的分子动力学模拟和先进的采样技术来计算H2O2通过隧道的能量障碍。

F182A突变体与野生型相比隧道势垒明显降低，导致H2O/H2O2分子向血红素活性位点的运输得到改善。这些结果为H2O2隧道工程策略的有效性提供了理论解释。

综上所述，本研究不仅为开发合成P450过氧化酶用于有价值化合物的有机转化提供了新思路，而且也凸显了通过H2O2隧道工程生成P450过氧化酶的潜力。这一创新有可能拓展P450酶在合成化学和生物学中的应用。